Электрофорез ДНК в агарозном геле
Основы и применение

Электрофорез ДНК - один из основных инструментов в молекулярной биологии.

Метод используется при:

  • разделение молекул ДНК и РНК по их размеру и определение размера по маркеру
  • определение примерного количества ДНК по яркости свечения
  • вырезание нужной ДНК из геля и использовать в дальнейшем
  • анализ результатов проведения ПЦР
  • используется при клонировании, при проведении операций с плазмидой - например вырезание участка из плазмиды с помощью рестриктаз и выделение его из геля после проведения электрофореза.
  • электрофорез ДНК - также применялся раньше для секвенирования по Сэнгеру, но гель использовался полиакриламидный(ПААГ) для точного разделения коротких молекул ДНК.Такой гель позволяет разделить молекулы , отличающиеся на 1 нуклеотид - хотя это и не так просто сделать.

Разделение фрагментов ДНК происходит из-за наличия у них заряда. Фосфатные остатки у нуклеотидов придают всей ДНК негативный заряд. Это делает ее растворимой в воде и привлекает ее к положительному(+) электроду. Поэтому, если поместить ДНК в электрическое поле, то она будет двигаться от минуса к плюсу. Чтобы ДНК не сильно бежала к плюсам, ее можно перемещать в какой-нибудь вязкой среде. Для этого и нужен агарозный гель (что-то очень похожее по консистенции на холодец или желе)

Фрагменты ДНК, имеющие наименьшую длину, приближаются быстрее всего к + электроду, в то время как длинные фрагменты остаются максимально близко к минусу. Те же базовые принципы электрофореза могут использоваться для разделения РНК и протеинов. Увеличение концентрации агарозы в геле уменьшает скорость миграции днк и позволяет разделять малые фрагменты днк. Чем больше напряжение тем быстрее проходит форез - но слишком сильное напряжение нагреет буфер а это недопустимо. Конформация днк тоже играет важную роль.Кольцевые плазмиды(неразрезанные рестриктазами) двигаются с другой скоростью чем линейные или суперскрученные.

Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, маркеры), содержащих линейные фрагменты ДНК известной длины.


ДНК маркер 100 (100-1000бп)

В буфере который заливают в камеру присутствует бромистый этидий (Ethidium bromide) - флюоресцентный краситель для окрашивания днк. Он мутагенен, поэтому при работе с ним лучше одевать перчатки. Этидий связывается с ДНК и после фореза гель смотрят под ультрафиолетом 312нм или 254нм в трансиллюминаторе. Этидий флюоресцирует под УФ и сам по себе, но при связывании с днк он светится гораздо сильнее.

Гели различаются по содержанию в них агарозы.Чем больше агарозы тем более мелкие фрагменты днк можно разделить Таблицу с % геля можно посмотреть здесь

Необходимые материалы
  • образец ДНК - молекулы днк которые нужно разделить либо определить их размер, объем 10-20 мкл
  • пипетка 20мкл
  • электрофорезная камера
    Камеру можно купить (рекомендую в ООО ИзоГель ) , но можно и сделать самому.Камера - это просто герметично склеенная коробочка из оргстекла с 2-я штекерами в которые вставляется питание, самое проблематичное здесь - это подобрать блок питания.
    В этой статье использовалась камера купленная в ООО ИзоГель
    Ссылки для тех кто захочет сделать камеру сам:
    http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/build_gel_box.pdf
    http://biohack.ru/?p=150
  • Источник питания на 50 - 150 В
  • гель - готовый или сделанный самостоятельно
    Готовые гели вместе с TAE(Tris-acetate-EDTA) буфером для фореза можно купить на сайте ООО ИзоГель , просто напишите по указанному на сайте email Там же можно приобрести электрофорезную камеру вместе с блоком питания.Все это вместе обойдется в несколько тысяч рублей. (альтернатива - коммерческие приборы, например Helicon , полный электрофорезный комплект обойдется тысяч в 20-30)
    Сам использую готовые гели - очень удобно и ничего не нужно заливать самому. Кстати гели и буфер многоразовые, если не обращать внимания на контаминацию то можно использовать один и тот же гель и буфер, после фореза просто класть в холодильник. Я пользовался одним комплектом( 4 геля + буфер) полгода.
  • Для приготовления 1% геля: 100 мл воды и 1 грамм агарозы
  • буфер TAE(Tris-acetate-EDTA), который в разбавленном виде заливается в камеру, объем в зависимости от размеров камеры
  • Loading buffer - обычно глицерин, объем 1 мкл
    При нанесении в лунки днк ,она сама по себе туда не опуститься, всплывет и рассеится по буферу. Чтобы этого не произошло и нужен глицерин или чтонибудь другое тяжелое.
  • Loading dye - краситель , объем 1 мкл
    Не обязателен, но позволяет визуально наблюдать за ходом электрофореза ( днк он конечно не покажет )
  • DNA ladder - маркер, по объему - столько же сколько и образца
    Необходим для определения размера образца.Маркер - фрагменты ДНК , определенного размера.
    Бывают разные Dna Ladder 100 , 50 , 25. Dna Ladder 100 - набор фрагментов от 100 нуклеотидов до 1000 с шагом в 100. Обычно наносятся в первую лунку и получаются в виде лесенки. Если нужно только узнать наличие\отсутствие днк в образце , то можно и без маркера. В маркер не нужно добавлять ни Loading buffer ни Loading dye.
  • трансиллюминатор или ультрафиолетовая лампа(например бытовая люминесцентная черная)
    Для визуализации подкрашенной этидиумом ДНК.


    Трансиллюминатор


    УФ светильник
Протокол
  1. Если вы не используете готовый гель - то нужно его приготовить
    Для 1% геля - смешайте 100 мл воды и 1 грамм агарозы в стеклянной посуде.Доведите раствор до кипения в микроволновой печи при высокой мощности. Вытащите сосуд из печи и размешайте до ресуспендирования осевшей агарозы.Охладите до температуры, комфортной для дальнейшей работы. В форму для геля установите гребенку под будущие лунки.Влейте охлажденную агарозу в форму. Агароза должна доходить как минимум до половины зубца гребенки.
    Когда гель затвердеет(для ускорения - засуньте в холодильник, но только не заморозьте), осторожно удалите гребенку.
  2. готовим камеру - кладем гель в камеру , заливаем буфер чтоб гель скрылся под ним удобнее всего гель класть в пластиковую кювету и уже ее в камеру.гель легко может сломаться при переносе в руках
  3. в образец добавим глицерин(Loading buffer) + краситель(loading dye)
    концентрация молекул днк в образце желательно > 50 нг/мл , чем меньше днк тем труднее увидеть ее на трансиллюминаторе чтобы получить четкий сигнал при окрашивании бромистым этидием, в лунку шириной 5 мм достаточно внести 200нг маркерной ДНК
  4. наносим образец в лунки , в первую лунку наносим маркер
    наносить нужно очень аккуратно, образец должен легко опуститься на дно и не выходить за пределы лунки, если образец всплыл и растекся сверху лунки - значит чтото не так, возможно не добавили глицерин или слишком резко выпустили образец из пипетки маркер обычно в лиофилизированном виде(черная точка на дне пробирки) - разбавляем в 4-7 мкл воды и хорошо перемешиваем пока днк не растворится
  5. включаем форез 120В 15-30 мин.Руки в камеру не сувать!
    возле электродов должны быть небольшие пузырьки, как индикатор что форез пошел днк двигается от минуса к плюсу , лунки с днк должны быть возле черного штекера (минуса)
    краситель в ходе фореза передвигается, по нему можно примерно определить куда могла убежать днк и когда закончить форез
  6. выключаем прибор, вытаскиваем гель.Просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют. Гель смотреть нужно в максимально темной комнате, иначе видимый свет забьет всю флюоресценцию от этидия. На фоне темно-синей подсветки уф в геле должны быть видны полоски красного цвета, особенно в колонке с маркером, тк концентрация маркерной днк достаточно большая Эти полоски и есть флюоресценция этидия , который связался с днк.


    Результат фореза
    При использовании обычного домашнего уф светильника,гель кладем сверху на лампу, полоски днк будут видны тускло, тк чуствительность лампы меньше чем трансиллюминатора . Также при использовании лампы вам понадобиться оранжевый(или желтый) светофильтр, который придется вытащить из галогенной лампочки аккуратно срезав верхний ее слой, сразу под ним будет круглое желтое стеклышко.Можно и без фильтра - но нужна большая концентрация днк, как например после удачно проведенной пцр. Светофильтр нужен чтоб убрать засветку видимым светом ( а желтый фильтр как раз пропускает только близкие к нему по цвету лучи, ослабляя остальные)
    Тк фильтр маленький его нужно положить сверху на гель в том месте где ожидаете увидеть днк. ну или повозюкать по всему гелю


    Галогенная лампочка


    Светофильтр из галогенной лампочки


    УФ лампа


    Форез после ПЦР
Ссылки
http://ru.wikipedia.org/wiki/Электрофорез_ДНК
http://ru.wikipedia.org/wiki/Бромистый_этидий
http://www.labx.narod.ru/documents/gel_electrophoresis_dna.html
http://molbiol.edu.ru/protocol/07_01.html
http://biohack.ru/?cat=8
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
http://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
http://beadle.rutgers.edu/MBB/315/Lec/Figs/AgaroseGelTutorial.pdf
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html
http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/
Видео
http://youtu.be/UYAGhRi30oM
http://youtu.be/YoKUiTWjy18
http://youtu.be/2UQIoYhOowM
http://youtu.be/U2-5ukpKg_Q
http://youtu.be/VWAMz6WLwM0
http://youtu.be/6mQGNDnOyH8
X