Трансформация E. Coli плазмидой pTZ59r. Метод теплового шока
Введение

В бактериях часть генетической информации содержится в коротких кольцевых молекулах ДНК - плазмидах. Трансформация заключается в введении в бактериальные клетки подобной плазмиды.Такая плазмида в некотором смысле аналогична хромосомной ДНК - она также реплицируется и наследуется при делении бактерии , несет в себе гены - которые транскрибируются и транслируются в белки. С помощью плазмид бактерии обмениваются друг с другом генетической информацией, — например, передают соседям устойчивость к какому-нибудь антибиотику. Плазмиду называют вектором, тк она несет в себе не только ген который мы хотим внедрить в бактерию,но и множество других участков необходимых для проживания плазмиды в бактерии и ее передаче потомству при делении.Также вектор обычно содержит селективные маркеры - гены устойчивости к антибиотикам.

Фактически трансформация является клонированием, тк в результате создаются клоны(колонии) бактерий произошедшие от одной бактерии - трансформированной и выжившей (благодаря трансформации) на селективном маркере.Реальная процедура клонирования включает множество этапов по подготовке вставляемого гена , вставки гена в плазмиду и трансформацию бактерии этой плазмидой.Мы же будет использовать готовую плазмиду и ничего в нее вставлять не будем.В плазмиде уже есть ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Клетки, получившие новый ген, называются трансформированными.

В смеси после проведения операции трансфекции имеется большое число нетрансформированных клеток. Необходимо отделить клетки, несущие новый ген, от массы исходных клеток. Для отделения клеток, прошедших трансформацию, от нетрансформированных культивирование ведут на селективных средах, содержащих антибиотики. В том случае, если плазмидный вектор содержит ген устойчивости к антибиотику и он попал в бактерию то начнет вырабатываться белок разрушающий антибиотик и бактерия не умрет.


Что там внутри

Для трансформации используются специальные лабораторные штаммы E. Coli , например E.Coli K12, E.Coli Xl1Blue
Эти штаммы специально модифицированны.В них например нет рестриктаз, которые разрезали бы чужую днк проникшую в бактерию.
E. coli относится к микроорганизмам, не обладающим естественной компетентностью к поглощению ДНК. Поэтому необходимо придать ей компетентность перед трансформацией. Липидная мембрана, которой окружены клетки, обладает избирательной проницаемостью — то есть, она пропускает через себя одни частицы и не пропускает другие. Крупные заряженные молекулы (а именно таковой и является ДНК) через эту мембрану самопроизвольно пройти не могут Есть много методов придания компетентности клеткам: химические(CaCl2), электропорация, экзотика(ультразвук,лазеры, генная пушка) ... Мы пропустим этап подготовки компетентных клеток, тк для многих таких методов нужна центрифуга, к томуже есть коммерчески доступные компетентные клетки

Метод теплового шока

В процессе теплового шока (нагревание до 42С) плазмиды проникают через поры в мембране бактерии.Тепловой шок - не придает клеткам компетентность а лишь помогает днк пройти через мембрану
В данной статье расмотрен метод с готовыми компетентными клетками и ампициллиновой селекцией.

Необходимые материалы
  • компетентные клетки EColi Xl1Blue(evrogen) - объем 100мкл
  • плазмида pTZ59r ( fermentas) , аналог pTZ19R, карта как у pAL-TA - объем 50мкл , концентрация 1 нг/мкл
    в данном опыте использовалась контрольная плазмида из набора , без гена для сине-белой селекции, но с геном устойчивости к ампициллину
  • среда LB (без агара) - объем 250 мкл
  • среда LB (с агаром) для посева - объем: половина чашки петри
  • Ampicillin - антибиотик - объем 50 мкл, концентрация 50 мкг/мл
  • термостат - воздушный, необязателен но очень желателен. Я использовал самодельный из пенопластовой коробки + простой нагреватель.
  • стеклянный шпатель - необходим для размазывания смеси по чашке петри, можно заменить чемнибудь другим
  • пипетка - большого объема чтоб набирать клетки и плазмиду


    Пипетка 1 мл с делениями
  • лед, порубленный на кусочки
Протокол
  1. сначала ставим пробирки с плазмидой, антибиотиком и EColi в лед пока не оттаят


    Вот такие кусочки льда нужны
  2. смешиваем плазмиду(50мкл) + клетки EColi (100мкл) и ставим опять в лед
  3. ждем 30 мин
  4. тепловой шок - ставим смесь в термостат 42С 40 сек Термостат можно заменить предварительно разогретой чашкой с водой
  5. смесь в лед возвращаем
  6. ждем 4 минуты
  7. добавляем в смесь среду LB (без агара) 250 мкл
  8. По идее надо поставить смесь в шейкер-термостат 37С на 60 мин, шйкер - 250 об/мин
    Шейкер я еще не доделал поэтому просто потряс 20 мин, зажав в руке ( чтоб температура была близко к 37С)
    Далее оставшиеся 40 мин положил в термостат на 37С
  9. Готовим чашки петри для посева:
  10. Наливаем в чашку петри среда LB (с агаром), в жидком предварительно разогретом состоянии(но не горячую) - половина чашки (или 1/3)
    Добавляем ампициллин 50 мкл.Антибиотик позволяет определить прошла трансформация или нет. Если трансформация получится то в бактерии будет плазмида с геном устойчивости к антибиотику ампицилину и они вырастут в чашке.
  11. закрываем чашку, сушим 37С примерно 1 час, пока среда не затвердеет
  12. Посев:
  13. выливаем смесь с клетками в чашку со средой
    смесь с клетками обычно размазывается по чашке специальным стеклянным шпателем, он окунается в спирт, поджигается , даем ему остыть, размазываем смесь по всей чашке, с минуту


    Размазываем по чашке
  14. Инкубация.
    чашку ставим в термостат 37С на 16 часов (обычно на ночь) Если термостата нет - то можно использовать батарею или настольную лампу, только предварительно измерив температуру.E.Coli могут расти в широком диапазоне температур 20-40 С(градусов), но скорость роста будет другая.При 28С - они будет расти 2 дня, при 21С - 3 дня.
    На чашках петри не должен образовываться конденсат воды, поэтому их надо завернуть в какойнибудь пакет который будет равномерно прогревать воздух внутри.
  15. в результате должны появиться много белых точек - колоний бактерий
    Каждая колония является потомством одной единственной трансформированной бактерии, попавшей вчера в чашку, соответственно все бактерии внутри одной колонии содержат один и тот же вектор.Далее можно поставить в холодильник на +4 - с недельку они могут так похраниться в живом состоянии


    Варианты того что может получится
    Вот что получилось у меня, но я переборщил с концетрацией плазмиды - плазмиды было во много раз больше чем нужно, поэтому колонии покрыли всю чашку. Справа наоборот, видно что там почти пусто, в этом месте я просто налил смесь, но не размазывал по чашке - видимо бактерии плохо растут в таких условиях и колоний не появилось, но позже там всетаки выросло несколько колоний


    Мой результат
Ссылки
http://biomolecula.ru/content/961
http://ru.wikipedia.org/wiki/Клонирование_ДНК
http://ru.wikipedia.org/wiki/Трансформация_(генетика)
http://tequals0.wordpress.com/2011/10/10/transformation/
Видео
http://labtutorials.org/2011/03/16/transformation-of-competent-cells/
http://www.dnatube.com/video/11810/Bacterial-Transformation
http://youtu.be/sovDqqhQJx8
Книги (есть в инете)
Гловер Клонирование днк
X